Kỹ thuật kháng globulin (Nghiệm pháp Coombs)

CN Huỳnh Thị Lệ Minh - Khoa HHTM

1. Đại cương

Trong miễn dịch huyết học có 2 loại kháng thể chính:

• Kháng thể hoàn toàn (thường là IgM) tạo phản ứng ngưng kết trong dịch treo nước muối.
• Kháng thể không hoàn toàn (IgG) bám lên hồng cầu nhưng không tạo nên ngưng kết trong dịch treo nước muối.

Sau khi kháng thể kết hợp với kháng nguyên tương ứng trên bề mặt hồng cầu, một số kháng thể có khả năng hoạt hóa bổ thể. Kỹ thuật kháng globulin (Nghiệm pháp Coombs) dùng để phát hiện hồng cầu đã gắn kháng thể (IgG) hay bổ thể.

2.  Nguyên lý

Kỹ thuật kháng globulin (Nghiệm pháp Coombs) dựa trên các nguyên lý sau:

• Phân tử kháng thể và bổ thể là globulin
• Tiêm vào động vật globulin người sẽ kích thích động vật tạo ra kháng thể với globulin này (AHG: anti human globulin).
• AHG sẽ phản ứng với phân tử globulin bám trên bề mặt hồng cầu hay tự do trong huyết thanh.

Có 2 loại nghiệm pháp Coombs trực tiếp và gián tiếp.

3. Nghiệm pháp Coombs (NP Coombs )

Nghiệm pháp Coombs trực tiếp: DAT (Direct antiglobulin test)

• NP Coombs trực tiếp dùng để phát hiện hồng cầu đã có kháng thể hay bổ thể bám vào in vivo.
• Một NP Coombs dương tính có thể không có biểu hiện tan máu miễn dịch.
• NP Coombs dương tính không phải là chẩn đoán, vai trò của nó chỉ được đánh giá trong mối liên quan với tình trạng lâm sàng của bệnh nhân.

Nghiệm pháp Coombs gián tiếp

• Nghiệm pháp Coombs gián tiếp phát hiện hồng cầu mẫn cảm (gắn kháng thể) in vitro, được sử dụng trong các trường hợp sau:
• Phát hiện kháng thể không hoàn toàn (IgG) với hồng cầu người cho (phản ứng chéo) hay với hồng cầu mẫu (xét nghiệm phát hiện kháng thể bất thường)
• Định danh kháng thể thông qua panel hồng cầu
• Xác định kiểu hình kháng nguyên (nhóm máu) của hồng cầu
• Làm hiệu giá với các kháng thể không hoàn toàn

4. Các yếu tố ảnh hưởng đến nhiệm pháp Coombs

• Tỷ lệ giữa huyết thanh và hồng cầu: Tăng tỷ lệ huyết thanh và hồng cầu sẽ tăng độ nhạy cảm. Tỷ lệ tối thiểu là 40:1
• Nhiệt độ: Phần lớn IgG và bổ thể đạt tốc độ phản ứng tối ưu ở 37ºC, vì thế chúng ta thường ủ ở nhiệt độ này trong NP Coombs gián tiếp
• Thời gian ủ: Khi hồng cầu huyền dịch trong nước muối, thời gian ủ từ 30-120 phút.
• Lực ion hóa: Trong dung dịch nước muối đẳng trương, các ion Na+ và Cl- sẽ trung hòa các vị trí có điện tích ngược dấu tương ứng trên hồng cầu(HC điện tích âm) và kháng thể làm ảnh hưởng đến sự kết hợp KN-KT
• Kỹ thuật rửa hồng cầu: Sau lần rửa cuối cùng, phải loại bỏ hoàn toàn nước muối, vì phần nước muối còn lại sẽ pha loang dung dịch AHG và làm giảm độ nhạy của phản ứng.
• Kỹ thuật thêm AHG:  AHG phải thêm vào hồng cầu ngay sau khi rửa xong để hạn chế tối đa kháng thể tách khỏi hồng cầu và trung hòa AHG.
• Ly tâm: Tốc độ ly tâm thường là 500-1000 vòng trong 20 giây. Tốc độ ly tâm cao sẽ cho phản ứng nhạy hơn. Tuy nhiên phụ thuộc vào cách lắc có thể tạo ra phản ứng dương tính giả do lắc chưa đủ mạnh hay phản ứng âm tính giả do lắc quá mạnh. Cần xác định tốc độ quay và thời gian ly tâm đối với từng máy cụ thể để có kết quả tốt nhất.

5. Một số lỗi trong nghiệm pháp Coombs

5.1. Âm tính giả

• Rửa hồng cầu không đúng kỹ thuật là nguyên nhân chính gây âm tính giả do các kháng thể tự do còn lại sau khi rửa sẽ trung hòa AHG
• Thao tác thực hiện chậm do đó kháng thể có thể tách khỏi hồng cầu
• Thuốc thử AHG mất tác dụng: do lưu trữ không đúng, nhiễm khuẩn.
• Ly tâm chưa đủ lực.
• Hồng cầu quá nhiều hay quá ít.
• Xử lý dung dịch nước muối cũ, có độ pH thấp.

5.2. Dương tính giả

• Hồng cầu ngưng kết trước khi rửa do tự kháng thể lạnh. Trong NP Coombs gián tiếp một vài kháng thể có thể ngưng kết trước khi thêm AHG, đây là phản ứng dương tính nhưng do kháng thể IgM chứ không phải do IgG hay bổ thể.
• Ống thủy tinh làm xét nghiệm bị bẩn, bụi có thể làm hồng cầu ngưng tập.
• Lực ly tâm quá mạnh, dẫn đến ngưng tập hồng cầu có thể nhầm với phản ứng ngưng kết.
• Bệnh nhân bị nhiễm trùng máu hay mẫu nghiệm bị nhiễm khuẩn có thể làm cho hồng cầu bộc lộ kháng nguyên T, nó sẽ ngưng kết với anti -T trong huyết tương của bệnh nhân.

6. Ứng dụng nghiệm pháp coombs trên lâm sàng

6.1. Bệnh tan máu ở trẻ sơ sinh: Xét nghiệm Coombs là một xét nghiệm chủ yếu cho phép thấy được sự mẫn cảm của hồng cầu trẻ sơ sinh với kháng thể đồng loại của mẹ. Trường hợp này Coombs trực tiếp dương tính rõ và kháng thể thuộc type IgG. Các bệnh tan máu thường liên quan đến anti D, anti c, anti E hoặc bệnh tan máu ở trẻ sơ sinh do bất đồng nhóm máu hệ ABO

6.2. Thiếu máu tan máu tự miễn (AHA- anemie hemolytiques auto immunes)

• AHA type IgG hoặc hỗn hợp: Là bệnh thường gặp ở ngưởi trẻ tuổi, đặc biệt là nữ giới, với biểu hiện tan máu hoặc hồng cầu bị giữ ở gan lách. Một số trường hợp có liên quan đến các bệnh tự miễn khác như lupus ban đỏ, xuất huyết giảm tiểu cầu
• AHA loại bổ thể đơn thuần hoặc có ngưng kết tố lạnh: Có thể tồn tại một cách tự nhiên ở người lớn tuổi. Tình trạng tan máu diễn ra một cách mãn tính không có giai đoạn tiến triển. Hồng cầu bị giữ trong hệ thống liên võng của gan và lách. Trong trường hợp này liệu pháp corticoid không có hiệu quả.
• Các trường hợp đặc biệt: Thiếu máu tan máu cấp có thể chửa khỏi ở trẻ em sau một giai đoạn viêm mũi, họng kéo dài khoảng 6 đến 8 ngày có thể xuất hiện một giai đoạn tan máu nặng. Nghiệm pháp Coombs trực tiếp cho kết quả dương tính thuộc type bổ thể. Lệu pháp corticodi cho kết quả khả quan. Tình trạng tan máu sẽ giảm dần sau vài ngày và bệnh nhân sẽ khỏi bệnh hoàn toàn sau vài tuần
• Thiếu máu tan máu do khối u: Xét nghiệm Coombs trực tiếp dương tính có thể gặp trên một u nang buồng trứng, khối u ác tính…. Sau phẩu thật khối u có thể làm ngừng quá trình tan máu.
• Thiếu máu tan máu do Methyl Dopa: Thực chất là bện tự miễn hoàn toàn khác biệt với bệnh thiếu máu tan máu miễn dịch  dị ứng khác. Ở đây không phải là một kháng thể kháng thuốc mà là một tự kháng thể. Nghiệm pháp Coombs trực tiếp thuộc type IgG
• Nghiệm pháp coombs trực tiếp âm tính trong trường hợp AHA thực sự

6.3. Xét nghiệm coombs trực tiếp trong trường hợp thiếu máu tan máu do dị ứng thuốc

• Thiếu máu tan máu do penicilline, nghiệm pháp coombs dương tính với loại IgG
• Thiếu máu tan máu do rifampicine, nghiệm pháp coombs dương tính với bổ thể

6.4. Xét nghiệm coombs trong truyền máu

• Tìm kháng thể bất thường
• Nghiệm pháp coombs trực tiếp với chẩn đoán tai biến tan máu trong bất đồng hòa hợp
• Nghiệm pháp coombs trực tiếp trong trường hợp tại biến do những người cho máu nguy hiểm

6.5. Xét nghiệm coombs gián tiếp trong định nhóm máu:

• Xác định nhóm máu Fya, Jka, Lea ….  

Tóm lại kết quả xét nghiệm Coombs trực tiếp hay gián tiếp dương tính là cơ sở cho việc chẩn đoán các trường hợp AHA (Anemie Hemolytiques Auto-immunes). Dựa vào đó có thể xác định yếu tố tự miễn dịch tự nhiên của thiếu máu tan máu, đưa ra các thông tin giúp bác sĩ lâm sàng chẩn đoán và theo dõi điều trị.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Quy chế truyền máu 2007 và một số văn bản quy phạm pháp luật về truyền máu. Hà Nội  2007, tr. 36.
2. George N, Woolf  H et al, Idiopathic thrombocytopenic purpura: a practice guideline developed by explicit methods for the American Society of Hematology, Blood 1996, 88: 3-40.
3. Snyder W, Cochran K et al,  Experience with protein A-immunoadsorption in treatment-resistant adult immunothrombocytopenic purpura,  Blood   1992, 79: 2237-45.